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技術共探 | 圓二色光譜法測定蛋白質熱變性溫度（Tm）的實踐
在全球生物醫藥產業高速發展的背景下，蛋白類藥物憑借其精準治療的顯著優勢，已成為制藥領域增長最快的細分賽道。蛋白質藥物的穩定性至關重要，直接關系到其療效、安全性和儲存運輸。
蛋白質的熱變性溫度（Tm）是指蛋白質在加熱過程中，發生熱變性解折疊50%時對應的溫度，是量化蛋白質穩定性的關鍵指標之一。準確測定 Tm值，對于蛋白類藥物開發、酶工程改造及理解蛋白-配體相互作用等具有重要的意義。
目前，常用的蛋白質 Tm 值測定方法主要有三種：差示掃描量熱法 (DSC)、圓二色光譜法 (CD) 和差示掃描熒光法 (DSF)。DSC是深度熱力學解析金標準，尤其適合精確測量變性熱力學參數 (ΔH, ΔCp) 的基礎研究或關鍵藥物表征；DSF快速、低消耗、高通量的特點，成為早期藥物發現、條件篩選 (緩沖液、pH、配體、穩定劑)、突變體庫篩選的首選工具；CD則是分析蛋白質高級結構變化的理想選擇。
本文重點介紹圓二色光譜法(CD)測定蛋白質熱變性溫度（Tm），從而分析蛋白類藥物二級和三級結構的原理和實踐，以饗讀者。
▉ 圓二色光譜法（CD）
圓二色光譜（Circular Dichroism，CD）是通過測量蛋白質分子對左右旋圓偏振光的吸收差異來研究蛋白質結構的技術。蛋白質的二級結構（如α-螺旋、β-折疊等）會導致分子對不同偏振光的吸收不同，這種吸收差異即為圓二色效應。利用遠紫外區（190-260nm）的光譜特征能夠快速分析出溶液中蛋白質的二級結構以及研究蛋白質的折疊和構象變化。CD通過實時監測蛋白質二級結構在升溫過程中的解折疊行為，以特征CD信號的突變為指標，信號發生顯著變化的溫度區域即對應變性過程，通過擬合可得到 Tm。其優勢在于無需標記或染色、靈敏度高，且能直接反映構象變化，是研究蛋白質穩定性的經典方法。
● 單點變溫法
樣品先進行190~260 nm的波譜掃描，確定其 CD 信號最高或最低的波長(即變溫實驗中變化最顯著的波長) ，在該波長下進行變溫掃描實時檢測。
● 全波長變溫法
樣品檢測中使用全波長變溫法，變溫掃描過程中檢測整個190~260 nm 波段的變化。
數據使用JASCO自帶軟件Spectra Manager進行分析。
實驗室的圓二色光譜儀為JASCO的J-1500，配備帕爾貼控溫設備以及微型水循環，升溫速度可調，溫控準確度優異，可滿足蛋白質熱變性等精密實驗需求。
案例分析
▉ 蛋白質熱變性溫度
蛋白樣品首先優化濃度和溫度范圍等條件，然后進行熱變性實驗，根據儀器配套軟件進行熱變性分析：1）每個波長的變溫曲線，2）溫度-波長CD三維圖，3）計算出熱力學參數（Tm值）等。
圖1 CD變溫掃描曲線
圖2 蛋白質熱變性溫度(Tm)
SGS實驗室在2022年受中國計量院（NIM）邀請參加英國國家物理實驗室（NPL）共同組織的“圓二色光譜（CD）進行小分子蛋白抗生素的熱穩定性研究”國際比對； 2024年又受邀參與中國計量院（NIM）組織的<蛋白質熱變性溫度（Tm值）的測定圓二色光譜法>團標起草和驗證工作，在相關領域積累了豐富的測試經驗。
作為全球知名的檢驗、鑒定、測試和認證機構，SGS在生物藥領域積累了強大的技術實力，能夠為客戶提供專業的檢測服務。
SGS生命科學實驗室的運作遵循高品質標準（cGMP & ISO 17025），多次通過FDA及地方管理機構審核。擁有超過十年以上的藥品和原輔料檢測經驗。擁有專業的項目研究及測試團隊，優質的分析設備，如CE, LCQTOF, LCMS/MS, CD, GC-FID/MS, HPLC等。
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