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技術(shù)共探 | 圓二色光譜法測定蛋白質(zhì)熱變性溫度（Tm）的實(shí)踐
在全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展的背景下，蛋白類藥物憑借其精準(zhǔn)治療的顯著優(yōu)勢，已成為制藥領(lǐng)域增長最快的細(xì)分賽道。蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性至關(guān)重要，直接關(guān)系到其療效、安全性和儲存運(yùn)輸。
蛋白質(zhì)的熱變性溫度（Tm）是指蛋白質(zhì)在加熱過程中，發(fā)生熱變性解折疊50%時對應(yīng)的溫度，是量化蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標(biāo)之一。準(zhǔn)確測定 Tm值，對于蛋白類藥物開發(fā)、酶工程改造及理解蛋白-配體相互作用等具有重要的意義。
目前，常用的蛋白質(zhì) Tm 值測定方法主要有三種：差示掃描量熱法 (DSC)、圓二色光譜法 (CD) 和差示掃描熒光法 (DSF)。DSC是深度熱力學(xué)解析金標(biāo)準(zhǔn)，尤其適合精確測量變性熱力學(xué)參數(shù) (ΔH, ΔCp) 的基礎(chǔ)研究或關(guān)鍵藥物表征；DSF快速、低消耗、高通量的特點(diǎn)，成為早期藥物發(fā)現(xiàn)、條件篩選 (緩沖液、pH、配體、穩(wěn)定劑)、突變體庫篩選的首選工具；CD則是分析蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)變化的理想選擇。
本文重點(diǎn)介紹圓二色光譜法(CD)測定蛋白質(zhì)熱變性溫度（Tm），從而分析蛋白類藥物二級和三級結(jié)構(gòu)的原理和實(shí)踐，以饗讀者。
▉ 圓二色光譜法（CD）
圓二色光譜（Circular Dichroism，CD）是通過測量蛋白質(zhì)分子對左右旋圓偏振光的吸收差異來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的技術(shù)。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（如α-螺旋、β-折疊等）會導(dǎo)致分子對不同偏振光的吸收不同，這種吸收差異即為圓二色效應(yīng)。利用遠(yuǎn)紫外區(qū)（190-260nm）的光譜特征能夠快速分析出溶液中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)以及研究蛋白質(zhì)的折疊和構(gòu)象變化。CD通過實(shí)時監(jiān)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)在升溫過程中的解折疊行為，以特征CD信號的突變?yōu)橹笜?biāo)，信號發(fā)生顯著變化的溫度區(qū)域即對應(yīng)變性過程，通過擬合可得到 Tm。其優(yōu)勢在于無需標(biāo)記或染色、靈敏度高，且能直接反映構(gòu)象變化，是研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的經(jīng)典方法。
● 單點(diǎn)變溫法
樣品先進(jìn)行190~260 nm的波譜掃描，確定其 CD 信號最高或最低的波長(即變溫實(shí)驗(yàn)中變化最顯著的波長) ，在該波長下進(jìn)行變溫掃描實(shí)時檢測。
● 全波長變溫法
樣品檢測中使用全波長變溫法，變溫掃描過程中檢測整個190~260 nm 波段的變化。
數(shù)據(jù)使用JASCO自帶軟件Spectra Manager進(jìn)行分析。
實(shí)驗(yàn)室的圓二色光譜儀為JASCO的J-1500，配備帕爾貼控溫設(shè)備以及微型水循環(huán)，升溫速度可調(diào)，溫控準(zhǔn)確度優(yōu)異，可滿足蛋白質(zhì)熱變性等精密實(shí)驗(yàn)需求。
案例分析
▉ 蛋白質(zhì)熱變性溫度
蛋白樣品首先優(yōu)化濃度和溫度范圍等條件，然后進(jìn)行熱變性實(shí)驗(yàn)，根據(jù)儀器配套軟件進(jìn)行熱變性分析：1）每個波長的變溫曲線，2）溫度-波長CD三維圖，3）計算出熱力學(xué)參數(shù)（Tm值）等。
圖1 CD變溫掃描曲線
圖2 蛋白質(zhì)熱變性溫度(Tm)
SGS實(shí)驗(yàn)室在2022年受中國計量院（NIM）邀請參加英國國家物理實(shí)驗(yàn)室（NPL）共同組織的“圓二色光譜（CD）進(jìn)行小分子蛋白抗生素的熱穩(wěn)定性研究”國際比對； 2024年又受邀參與中國計量院（NIM）組織的<蛋白質(zhì)熱變性溫度（Tm值）的測定圓二色光譜法>團(tuán)標(biāo)起草和驗(yàn)證工作，在相關(guān)領(lǐng)域積累了豐富的測試經(jīng)驗(yàn)。
作為全球知名的檢驗(yàn)、鑒定、測試和認(rèn)證機(jī)構(gòu)，SGS在生物藥領(lǐng)域積累了強(qiáng)大的技術(shù)實(shí)力，能夠?yàn)榭蛻籼峁I(yè)的檢測服務(wù)。
SGS生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)作遵循高品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（cGMP & ISO 17025），多次通過FDA及地方管理機(jī)構(gòu)審核。擁有超過十年以上的藥品和原輔料檢測經(jīng)驗(yàn)。擁有專業(yè)的項目研究及測試團(tuán)隊，優(yōu)質(zhì)的分析設(shè)備，如CE, LCQTOF, LCMS/MS, CD, GC-FID/MS, HPLC等。
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