大分子藥物PK分析

法規(guī)對(duì)于驗(yàn)證主要參數(shù)有哪些新要求？我們共同來(lái)探討一下。

大多數(shù)情況下，微量滴定板用于LBA，研究樣品需按照方案、研究計(jì)劃或SOP中規(guī)定使用每個(gè)樣品1個(gè)或多個(gè)孔的分析格式進(jìn)行分析，且樣品分析時(shí)需與方法開(kāi)發(fā)及驗(yàn)證保持相同的分析格式。如果每個(gè)樣品使用多個(gè)孔，則應(yīng)通過(guò)計(jì)算重復(fù)孔響應(yīng)的平均值或通過(guò)平均每個(gè)響應(yīng)計(jì)算的濃度來(lái)確定可報(bào)告的樣品濃度。

1. 校準(zhǔn)曲線和其范圍

校正標(biāo)樣應(yīng)在與研究樣品相同的生物基質(zhì)中制備。校準(zhǔn)范圍由最低校正標(biāo)樣（LLOQ）和最高校正標(biāo)樣（ULOQ）定義。在方法驗(yàn)證期間和每次分析運(yùn)行期間，應(yīng)為研究的每個(gè)分析物提供一條校準(zhǔn)曲線。如果需要使用替代基質(zhì)，應(yīng)具有科學(xué)合理性。

應(yīng)使用至少6個(gè)濃度水平的校正標(biāo)樣（包括LLOQ和ULOQ）以及空白樣品生成校準(zhǔn)曲線。空白樣品不應(yīng)包括在校準(zhǔn)曲線參數(shù)的計(jì)算中。濃度低于校準(zhǔn)曲線LLOQ且高于ULOQ的錨定點(diǎn)樣品也可用于改進(jìn)曲線擬合。錨定點(diǎn)沒(méi)有接受標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗鼈兂隽饲€的可量化范圍。

最好使用分析當(dāng)天配制的校正標(biāo)樣制備校準(zhǔn)曲線。如果未使用新鮮的校正標(biāo)樣，則可在規(guī)定的穩(wěn)定期內(nèi)使用冷凍的校正標(biāo)樣。

2. 準(zhǔn)確度和精密度

用于制備QCs的稀釋系列應(yīng)完全獨(dú)立于用于制備校正標(biāo)樣的稀釋系列。可使用相同的儲(chǔ)備溶液（或工作原液）制備，前提是已驗(yàn)證準(zhǔn)確的制備和穩(wěn)定性。應(yīng)在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)至少5個(gè)濃度水平下制備QCs即在LLOQ、LLOQ的三倍范圍內(nèi)（低濃度QC）、校準(zhǔn)曲線范圍的幾何平均值周圍（中等濃度QC）以及至少75%的ULOQ（高濃度QC）和ULOQ處添加分析物。

準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)在至少2天至少6次運(yùn)行中，在每個(gè)QC濃度水平（LLOQ、低濃度QC、中等濃度QC、高濃度QC、ULOQ）下，每次運(yùn)行至少分析3個(gè)重復(fù)來(lái)確定。報(bào)告的方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)以及準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定應(yīng)包括獲得的所有結(jié)果，但錯(cuò)誤明顯且記錄在案的情況除外。

3. 選擇性/基質(zhì)效應(yīng)

選擇性應(yīng)在最可能出現(xiàn)問(wèn)題的分析低端評(píng)估，但建議在較高分析物濃度下也評(píng)估選擇性。因此，使用從至少10個(gè)單獨(dú)來(lái)源獲得的空白樣品，并通過(guò)在LLOQ和高濃度QC水平下添加單獨(dú)空白基質(zhì)來(lái)評(píng)估選擇性。在稀有基質(zhì)的情況下，可以使用較少的來(lái)源。

應(yīng)評(píng)估血脂樣品的選擇性，至少使用一種基質(zhì)來(lái)源。為了具有科學(xué)意義，用于這些測(cè)試的基質(zhì)應(yīng)盡可能代表預(yù)期的研究樣本，應(yīng)該從獻(xiàn)血者處獲得甘油三酯含量異常高的天然血脂基質(zhì)或在基質(zhì)中可以摻入甘油三酯。然而，如果藥物影響脂質(zhì)代謝或預(yù)期患者群體患有高脂血癥，則不鼓勵(lì)使用加標(biāo)樣品。非臨床研究無(wú)需進(jìn)行此評(píng)估，除非該藥物影響脂質(zhì)代謝或用于高脂血癥的特定動(dòng)物品系。

應(yīng)評(píng)估溶血樣品的選擇性，至少使用一種基質(zhì)來(lái)源。通過(guò)在基質(zhì)中加入溶血全血（至少2%V/V）來(lái)獲得溶血基質(zhì)，以生成明顯可檢測(cè)的溶血樣品。應(yīng)在相關(guān)患者群體的樣本中評(píng)估選擇性，至少有五名患者。

4. 特異性

特異性與LBA中的交叉反應(yīng)性概念有關(guān)。重要的是，結(jié)合試劑與目標(biāo)分析物特異性結(jié)合，但不會(huì)與共存的結(jié)構(gòu)相關(guān)分子（例如內(nèi)源性化合物、異構(gòu)體或結(jié)構(gòu)相關(guān)的伴隨藥物）發(fā)生交叉反應(yīng)。通過(guò)在空白基質(zhì)樣品中加入研究樣品中預(yù)期結(jié)構(gòu)相關(guān)分子的最大濃度來(lái)評(píng)估特異性，研究LLOQ和ULOQ下目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確性。

如果出現(xiàn)非特異性，應(yīng)通過(guò)增加空白基質(zhì)中干擾分子的濃度并測(cè)量LLOQ和ULOQ下目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確度來(lái)評(píng)估對(duì)方法的影響。必須確定發(fā)生干擾的相關(guān)分子的最小濃度。

在方法開(kāi)發(fā)和早期方法驗(yàn)證期間，這些“相關(guān)分子”通常不可用。原始驗(yàn)證完成后，可進(jìn)行額外的特異性評(píng)估。

5. 稀釋線性與鉤狀效應(yīng)

由于許多LBA的分析范圍較窄，研究樣品可能需要稀釋，以便在分析范圍內(nèi)達(dá)到分析物濃度。評(píng)估稀釋線性是為確認(rèn)測(cè)量濃度不受校準(zhǔn)范圍內(nèi)稀釋的影響，以及校準(zhǔn)曲線ULOQ以上的樣品濃度不受鉤狀效應(yīng)（即，分析物高濃度引起的信號(hào)抑制）的影響，從而產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。

應(yīng)使用與研究樣品相同的基質(zhì)制備QCs進(jìn)行稀釋。稀釋線性應(yīng)通過(guò)生成稀釋QC來(lái)證明，即用高于ULOQ濃度的分析物加入基質(zhì)，分析未稀釋（為了鉤狀效應(yīng)）和用空白基質(zhì)稀釋的至校準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)的樣品（至少3個(gè)不同的稀釋因子）。對(duì)于測(cè)試的每個(gè)稀釋因子，應(yīng)使制備至少3個(gè)獨(dú)立的稀釋系列。在稀釋QCs中檢查是否存在響應(yīng)降低（鉤狀效應(yīng)），如果觀察到并且無(wú)法通過(guò)合理措施消除，則應(yīng)在分析研究樣品期間采取措施減輕該影響。

研究樣品分析期間應(yīng)用的稀釋因子應(yīng)在驗(yàn)證期間評(píng)估的稀釋因子范圍內(nèi)。

6. 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性評(píng)估是為確保樣品制備、處理和分析過(guò)程中采取的每一步以及使用的儲(chǔ)存條件不會(huì)影響分析物的濃度。

用于穩(wěn)定性試驗(yàn)的儲(chǔ)存和分析條件，如樣品儲(chǔ)存時(shí)間和溫度、樣品基質(zhì)、抗凝劑和容器材料，應(yīng)反映用于研究樣品的條件。參考文獻(xiàn)中公布的數(shù)據(jù)被認(rèn)為是不夠的。儲(chǔ)存期的驗(yàn)證應(yīng)通過(guò)儲(chǔ)存時(shí)間等于或長(zhǎng)于研究樣品的QCs來(lái)驗(yàn)證。

用于穩(wěn)定性試驗(yàn)的校準(zhǔn)曲線是分析當(dāng)天新鮮配制的。雖然使用新制備的校正標(biāo)樣和QCs是首選方法，但在某些情況下，對(duì)于大分子，可能需要將其冷凍過(guò)夜。在這種情況下，應(yīng)提供有效的理由，并證明凍融穩(wěn)定性。QCs應(yīng)在凍融循環(huán)之間至少凍結(jié)12小時(shí)。

由于校準(zhǔn)曲線范圍狹窄，許多LBA方法可能需要樣品稀釋，因此研究樣品的濃度可能始終高于校準(zhǔn)曲線的ULOQ。如果是這種情況，考慮到應(yīng)用的樣品稀釋度，應(yīng)調(diào)整QCs的濃度，以代表實(shí)際樣品濃度范圍。

對(duì)于固定劑量的組合產(chǎn)品和專門(mén)標(biāo)記的藥物方案，基質(zhì)中分析物的凍融、臺(tái)面和長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)應(yīng)在基質(zhì)中加入所有給藥化合物的情況下進(jìn)行，具體視情況而定。

對(duì)于生物藥物如果在-70/-80°C和-20°C下證明了穩(wěn)定性，則無(wú)需在儲(chǔ)存研究樣品的這兩個(gè)溫度點(diǎn)之間調(diào)查穩(wěn)定性。

7. 平行性

平行性定義為校準(zhǔn)曲線和連續(xù)稀釋研究樣品之間的平行關(guān)系，以檢測(cè)稀釋對(duì)分析物測(cè)量的任何影響。通常，由于在方法開(kāi)發(fā)或驗(yàn)證期間研究樣品不可用，這些實(shí)驗(yàn)應(yīng)在研究樣品分析期間進(jìn)行。應(yīng)使用空白基質(zhì)將高濃度（最好接近Cmax）的研究樣品稀釋校準(zhǔn)范圍內(nèi)至少三個(gè)濃度（包含在校準(zhǔn)范圍內(nèi)）。稀釋系列樣品之間反算濃度的一致性不得超過(guò)30%CV。然而，當(dāng)應(yīng)用30%的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)仔細(xì)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)該標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果仍可能顯示出不平行的趨勢(shì)。如果樣品沒(méi)有線性稀釋（即，以非平行方式），則應(yīng)事先確定報(bào)告結(jié)果的程序。

以上就是法規(guī)對(duì)于PK分析全面驗(yàn)證參數(shù)的要求。這些驗(yàn)證參數(shù)的接受標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)準(zhǔn)確度和精密度分析確定，法規(guī)規(guī)定加入分析物的校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品和驗(yàn)證樣品的精密度≤20%（ULOQ和LLOQ水平≤25%），準(zhǔn)確度在±20%范圍內(nèi)（ULOQ和LLOQ水平在±25%范圍內(nèi)）。

SGS生物分析中心完全具備開(kāi)展全面方法驗(yàn)證的實(shí)力，各位專題負(fù)責(zé)人都擁有多年方法開(kāi)發(fā)和方法驗(yàn)證的經(jīng)驗(yàn)，他們主導(dǎo)或參與過(guò)的生物藥分析方法的驗(yàn)證均接受過(guò)國(guó)家局或申辦方的審查。歡迎各合作伙伴參觀考察。