大分子藥物PK分析

法規對于驗證主要參數有哪些新要求？我們共同來探討一下。

大多數情況下，微量滴定板用于LBA，研究樣品需按照方案、研究計劃或SOP中規定使用每個樣品1個或多個孔的分析格式進行分析，且樣品分析時需與方法開發及驗證保持相同的分析格式。如果每個樣品使用多個孔，則應通過計算重復孔響應的平均值或通過平均每個響應計算的濃度來確定可報告的樣品濃度。

1. 校準曲線和其范圍

校正標樣應在與研究樣品相同的生物基質中制備。校準范圍由最低校正標樣（LLOQ）和最高校正標樣（ULOQ）定義。在方法驗證期間和每次分析運行期間，應為研究的每個分析物提供一條校準曲線。如果需要使用替代基質，應具有科學合理性。

應使用至少6個濃度水平的校正標樣（包括LLOQ和ULOQ）以及空白樣品生成校準曲線。空白樣品不應包括在校準曲線參數的計算中。濃度低于校準曲線LLOQ且高于ULOQ的錨定點樣品也可用于改進曲線擬合。錨定點沒有接受標準，因為它們超出了曲線的可量化范圍。

最好使用分析當天配制的校正標樣制備校準曲線。如果未使用新鮮的校正標樣，則可在規定的穩定期內使用冷凍的校正標樣。

2. 準確度和精密度

用于制備QCs的稀釋系列應完全獨立于用于制備校正標樣的稀釋系列。可使用相同的儲備溶液（或工作原液）制備，前提是已驗證準確的制備和穩定性。應在校準曲線范圍內至少5個濃度水平下制備QCs即在LLOQ、LLOQ的三倍范圍內（低濃度QC）、校準曲線范圍的幾何平均值周圍（中等濃度QC）以及至少75%的ULOQ（高濃度QC）和ULOQ處添加分析物。

準確度和精密度應在至少2天至少6次運行中，在每個QC濃度水平（LLOQ、低濃度QC、中等濃度QC、高濃度QC、ULOQ）下，每次運行至少分析3個重復來確定。報告的方法驗證數據以及準確度和精密度的測定應包括獲得的所有結果，但錯誤明顯且記錄在案的情況除外。

3. 選擇性/基質效應

選擇性應在最可能出現問題的分析低端評估，但建議在較高分析物濃度下也評估選擇性。因此，使用從至少10個單獨來源獲得的空白樣品，并通過在LLOQ和高濃度QC水平下添加單獨空白基質來評估選擇性。在稀有基質的情況下，可以使用較少的來源。

應評估血脂樣品的選擇性，至少使用一種基質來源。為了具有科學意義，用于這些測試的基質應盡可能代表預期的研究樣本，應該從獻血者處獲得甘油三酯含量異常高的天然血脂基質或在基質中可以摻入甘油三酯。然而，如果藥物影響脂質代謝或預期患者群體患有高脂血癥，則不鼓勵使用加標樣品。非臨床研究無需進行此評估，除非該藥物影響脂質代謝或用于高脂血癥的特定動物品系。

應評估溶血樣品的選擇性，至少使用一種基質來源。通過在基質中加入溶血全血（至少2%V/V）來獲得溶血基質，以生成明顯可檢測的溶血樣品。應在相關患者群體的樣本中評估選擇性，至少有五名患者。

4. 特異性

特異性與LBA中的交叉反應性概念有關。重要的是，結合試劑與目標分析物特異性結合，但不會與共存的結構相關分子（例如內源性化合物、異構體或結構相關的伴隨藥物）發生交叉反應。通過在空白基質樣品中加入研究樣品中預期結構相關分子的最大濃度來評估特異性，研究LLOQ和ULOQ下目標分析物的準確性。

如果出現非特異性，應通過增加空白基質中干擾分子的濃度并測量LLOQ和ULOQ下目標分析物的準確度來評估對方法的影響。必須確定發生干擾的相關分子的最小濃度。

在方法開發和早期方法驗證期間，這些“相關分子”通常不可用。原始驗證完成后，可進行額外的特異性評估。

5. 稀釋線性與鉤狀效應

由于許多LBA的分析范圍較窄，研究樣品可能需要稀釋，以便在分析范圍內達到分析物濃度。評估稀釋線性是為確認測量濃度不受校準范圍內稀釋的影響，以及校準曲線ULOQ以上的樣品濃度不受鉤狀效應（即，分析物高濃度引起的信號抑制）的影響，從而產生錯誤結果。

應使用與研究樣品相同的基質制備QCs進行稀釋。稀釋線性應通過生成稀釋QC來證明，即用高于ULOQ濃度的分析物加入基質，分析未稀釋（為了鉤狀效應）和用空白基質稀釋的至校準濃度范圍內的樣品（至少3個不同的稀釋因子）。對于測試的每個稀釋因子，應使制備至少3個獨立的稀釋系列。在稀釋QCs中檢查是否存在響應降低（鉤狀效應），如果觀察到并且無法通過合理措施消除，則應在分析研究樣品期間采取措施減輕該影響。

研究樣品分析期間應用的稀釋因子應在驗證期間評估的稀釋因子范圍內。

6. 穩定性

穩定性評估是為確保樣品制備、處理和分析過程中采取的每一步以及使用的儲存條件不會影響分析物的濃度。

用于穩定性試驗的儲存和分析條件，如樣品儲存時間和溫度、樣品基質、抗凝劑和容器材料，應反映用于研究樣品的條件。參考文獻中公布的數據被認為是不夠的。儲存期的驗證應通過儲存時間等于或長于研究樣品的QCs來驗證。

用于穩定性試驗的校準曲線是分析當天新鮮配制的。雖然使用新制備的校正標樣和QCs是首選方法，但在某些情況下，對于大分子，可能需要將其冷凍過夜。在這種情況下，應提供有效的理由，并證明凍融穩定性。QCs應在凍融循環之間至少凍結12小時。

由于校準曲線范圍狹窄，許多LBA方法可能需要樣品稀釋，因此研究樣品的濃度可能始終高于校準曲線的ULOQ。如果是這種情況，考慮到應用的樣品稀釋度，應調整QCs的濃度，以代表實際樣品濃度范圍。

對于固定劑量的組合產品和專門標記的藥物方案，基質中分析物的凍融、臺面和長期穩定性試驗應在基質中加入所有給藥化合物的情況下進行，具體視情況而定。

對于生物藥物如果在-70/-80°C和-20°C下證明了穩定性，則無需在儲存研究樣品的這兩個溫度點之間調查穩定性。

7. 平行性

平行性定義為校準曲線和連續稀釋研究樣品之間的平行關系，以檢測稀釋對分析物測量的任何影響。通常，由于在方法開發或驗證期間研究樣品不可用，這些實驗應在研究樣品分析期間進行。應使用空白基質將高濃度（最好接近Cmax）的研究樣品稀釋校準范圍內至少三個濃度（包含在校準范圍內）。稀釋系列樣品之間反算濃度的一致性不得超過30%CV。然而，當應用30%的標準時，應仔細監測數據，因為通過該標準的結果仍可能顯示出不平行的趨勢。如果樣品沒有線性稀釋（即，以非平行方式），則應事先確定報告結果的程序。

以上就是法規對于PK分析全面驗證參數的要求。這些驗證參數的接受標準通過準確度和精密度分析確定，法規規定加入分析物的校正標樣、質控樣品和驗證樣品的精密度≤20%（ULOQ和LLOQ水平≤25%），準確度在±20%范圍內（ULOQ和LLOQ水平在±25%范圍內）。

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