大分子藥物PK分析

法規(guī)對于驗(yàn)證主要參數(shù)有哪些新要求？我們共同來探討一下。

大多數(shù)情況下，微量滴定板用于LBA，研究樣品需按照方案、研究計劃或SOP中規(guī)定使用每個樣品1個或多個孔的分析格式進(jìn)行分析，且樣品分析時需與方法開發(fā)及驗(yàn)證保持相同的分析格式。如果每個樣品使用多個孔，則應(yīng)通過計算重復(fù)孔響應(yīng)的平均值或通過平均每個響應(yīng)計算的濃度來確定可報告的樣品濃度。

1. 校準(zhǔn)曲線和其范圍

校正標(biāo)樣應(yīng)在與研究樣品相同的生物基質(zhì)中制備。校準(zhǔn)范圍由最低校正標(biāo)樣（LLOQ）和最高校正標(biāo)樣（ULOQ）定義。在方法驗(yàn)證期間和每次分析運(yùn)行期間，應(yīng)為研究的每個分析物提供一條校準(zhǔn)曲線。如果需要使用替代基質(zhì)，應(yīng)具有科學(xué)合理性。

應(yīng)使用至少6個濃度水平的校正標(biāo)樣（包括LLOQ和ULOQ）以及空白樣品生成校準(zhǔn)曲線?？瞻讟悠凡粦?yīng)包括在校準(zhǔn)曲線參數(shù)的計算中。濃度低于校準(zhǔn)曲線LLOQ且高于ULOQ的錨定點(diǎn)樣品也可用于改進(jìn)曲線擬合。錨定點(diǎn)沒有接受標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗鼈兂隽饲€的可量化范圍。

最好使用分析當(dāng)天配制的校正標(biāo)樣制備校準(zhǔn)曲線。如果未使用新鮮的校正標(biāo)樣，則可在規(guī)定的穩(wěn)定期內(nèi)使用冷凍的校正標(biāo)樣。

2. 準(zhǔn)確度和精密度

用于制備QCs的稀釋系列應(yīng)完全獨(dú)立于用于制備校正標(biāo)樣的稀釋系列。可使用相同的儲備溶液（或工作原液）制備，前提是已驗(yàn)證準(zhǔn)確的制備和穩(wěn)定性。應(yīng)在校準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)至少5個濃度水平下制備QCs即在LLOQ、LLOQ的三倍范圍內(nèi)（低濃度QC）、校準(zhǔn)曲線范圍的幾何平均值周圍（中等濃度QC）以及至少75%的ULOQ（高濃度QC）和ULOQ處添加分析物。

準(zhǔn)確度和精密度應(yīng)在至少2天至少6次運(yùn)行中，在每個QC濃度水平（LLOQ、低濃度QC、中等濃度QC、高濃度QC、ULOQ）下，每次運(yùn)行至少分析3個重復(fù)來確定。報告的方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)以及準(zhǔn)確度和精密度的測定應(yīng)包括獲得的所有結(jié)果，但錯誤明顯且記錄在案的情況除外。

3. 選擇性/基質(zhì)效應(yīng)

選擇性應(yīng)在最可能出現(xiàn)問題的分析低端評估，但建議在較高分析物濃度下也評估選擇性。因此，使用從至少10個單獨(dú)來源獲得的空白樣品，并通過在LLOQ和高濃度QC水平下添加單獨(dú)空白基質(zhì)來評估選擇性。在稀有基質(zhì)的情況下，可以使用較少的來源。

應(yīng)評估血脂樣品的選擇性，至少使用一種基質(zhì)來源。為了具有科學(xué)意義，用于這些測試的基質(zhì)應(yīng)盡可能代表預(yù)期的研究樣本，應(yīng)該從獻(xiàn)血者處獲得甘油三酯含量異常高的天然血脂基質(zhì)或在基質(zhì)中可以摻入甘油三酯。然而，如果藥物影響脂質(zhì)代謝或預(yù)期患者群體患有高脂血癥，則不鼓勵使用加標(biāo)樣品。非臨床研究無需進(jìn)行此評估，除非該藥物影響脂質(zhì)代謝或用于高脂血癥的特定動物品系。

應(yīng)評估溶血樣品的選擇性，至少使用一種基質(zhì)來源。通過在基質(zhì)中加入溶血全血（至少2%V/V）來獲得溶血基質(zhì)，以生成明顯可檢測的溶血樣品。應(yīng)在相關(guān)患者群體的樣本中評估選擇性，至少有五名患者。

4. 特異性

特異性與LBA中的交叉反應(yīng)性概念有關(guān)。重要的是，結(jié)合試劑與目標(biāo)分析物特異性結(jié)合，但不會與共存的結(jié)構(gòu)相關(guān)分子（例如內(nèi)源性化合物、異構(gòu)體或結(jié)構(gòu)相關(guān)的伴隨藥物）發(fā)生交叉反應(yīng)。通過在空白基質(zhì)樣品中加入研究樣品中預(yù)期結(jié)構(gòu)相關(guān)分子的最大濃度來評估特異性，研究LLOQ和ULOQ下目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確性。

如果出現(xiàn)非特異性，應(yīng)通過增加空白基質(zhì)中干擾分子的濃度并測量LLOQ和ULOQ下目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確度來評估對方法的影響。必須確定發(fā)生干擾的相關(guān)分子的最小濃度。

在方法開發(fā)和早期方法驗(yàn)證期間，這些“相關(guān)分子”通常不可用。原始驗(yàn)證完成后，可進(jìn)行額外的特異性評估。

5. 稀釋線性與鉤狀效應(yīng)

由于許多LBA的分析范圍較窄，研究樣品可能需要稀釋，以便在分析范圍內(nèi)達(dá)到分析物濃度。評估稀釋線性是為確認(rèn)測量濃度不受校準(zhǔn)范圍內(nèi)稀釋的影響，以及校準(zhǔn)曲線ULOQ以上的樣品濃度不受鉤狀效應(yīng)（即，分析物高濃度引起的信號抑制）的影響，從而產(chǎn)生錯誤結(jié)果。

應(yīng)使用與研究樣品相同的基質(zhì)制備QCs進(jìn)行稀釋。稀釋線性應(yīng)通過生成稀釋QC來證明，即用高于ULOQ濃度的分析物加入基質(zhì)，分析未稀釋（為了鉤狀效應(yīng)）和用空白基質(zhì)稀釋的至校準(zhǔn)濃度范圍內(nèi)的樣品（至少3個不同的稀釋因子）。對于測試的每個稀釋因子，應(yīng)使制備至少3個獨(dú)立的稀釋系列。在稀釋QCs中檢查是否存在響應(yīng)降低（鉤狀效應(yīng)），如果觀察到并且無法通過合理措施消除，則應(yīng)在分析研究樣品期間采取措施減輕該影響。

研究樣品分析期間應(yīng)用的稀釋因子應(yīng)在驗(yàn)證期間評估的稀釋因子范圍內(nèi)。

6. 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性評估是為確保樣品制備、處理和分析過程中采取的每一步以及使用的儲存條件不會影響分析物的濃度。

用于穩(wěn)定性試驗(yàn)的儲存和分析條件，如樣品儲存時間和溫度、樣品基質(zhì)、抗凝劑和容器材料，應(yīng)反映用于研究樣品的條件。參考文獻(xiàn)中公布的數(shù)據(jù)被認(rèn)為是不夠的。儲存期的驗(yàn)證應(yīng)通過儲存時間等于或長于研究樣品的QCs來驗(yàn)證。

用于穩(wěn)定性試驗(yàn)的校準(zhǔn)曲線是分析當(dāng)天新鮮配制的。雖然使用新制備的校正標(biāo)樣和QCs是首選方法，但在某些情況下，對于大分子，可能需要將其冷凍過夜。在這種情況下，應(yīng)提供有效的理由，并證明凍融穩(wěn)定性。QCs應(yīng)在凍融循環(huán)之間至少凍結(jié)12小時。

由于校準(zhǔn)曲線范圍狹窄，許多LBA方法可能需要樣品稀釋，因此研究樣品的濃度可能始終高于校準(zhǔn)曲線的ULOQ。如果是這種情況，考慮到應(yīng)用的樣品稀釋度，應(yīng)調(diào)整QCs的濃度，以代表實(shí)際樣品濃度范圍。

對于固定劑量的組合產(chǎn)品和專門標(biāo)記的藥物方案，基質(zhì)中分析物的凍融、臺面和長期穩(wěn)定性試驗(yàn)應(yīng)在基質(zhì)中加入所有給藥化合物的情況下進(jìn)行，具體視情況而定。

對于生物藥物如果在-70/-80°C和-20°C下證明了穩(wěn)定性，則無需在儲存研究樣品的這兩個溫度點(diǎn)之間調(diào)查穩(wěn)定性。

7. 平行性

平行性定義為校準(zhǔn)曲線和連續(xù)稀釋研究樣品之間的平行關(guān)系，以檢測稀釋對分析物測量的任何影響。通常，由于在方法開發(fā)或驗(yàn)證期間研究樣品不可用，這些實(shí)驗(yàn)應(yīng)在研究樣品分析期間進(jìn)行。應(yīng)使用空白基質(zhì)將高濃度（最好接近Cmax）的研究樣品稀釋校準(zhǔn)范圍內(nèi)至少三個濃度（包含在校準(zhǔn)范圍內(nèi)）。稀釋系列樣品之間反算濃度的一致性不得超過30%CV。然而，當(dāng)應(yīng)用30%的標(biāo)準(zhǔn)時，應(yīng)仔細(xì)監(jiān)測數(shù)據(jù)，因?yàn)橥ㄟ^該標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果仍可能顯示出不平行的趨勢。如果樣品沒有線性稀釋（即，以非平行方式），則應(yīng)事先確定報告結(jié)果的程序。

以上就是法規(guī)對于PK分析全面驗(yàn)證參數(shù)的要求。這些驗(yàn)證參數(shù)的接受標(biāo)準(zhǔn)通過準(zhǔn)確度和精密度分析確定，法規(guī)規(guī)定加入分析物的校正標(biāo)樣、質(zhì)控樣品和驗(yàn)證樣品的精密度≤20%（ULOQ和LLOQ水平≤25%），準(zhǔn)確度在±20%范圍內(nèi)（ULOQ和LLOQ水平在±25%范圍內(nèi)）。

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